深度！最全干眼症模型研究，看这篇就够了
干眼症(dryeyesyndrome，xeorphhtalmia)又名结膜干燥综合征，是一种受眼部和/或全身多种因素(如眼表功能障碍、眼部外伤、糖尿病、炎症等)影响出现泪腺低分泌而导致泪膜异常、眼表上皮干变的常见眼科疾病。干眼症患者的临床初始表现包括异物感、干涩感、发痒、烧灼感、畏光、视物�：�、易视疲劳、难以名状的不适及不能耐受有烟尘的环境等 。这些症状随病情进展而加重，最终出现角膜溃疡甚至失明。目前临床主要通过外科手术或药物治疗来恢复泪液和黏液的分泌，改善角膜组织病变，但都不能治愈。建立合适的干眼动物模型对药物作用机制的探讨、药物疗效的评价以及干眼病因病机的研究都具有重大的意义。
泪液由泪腺分泌，其中95%以上由主泪腺分泌，少部分泪液来自副泪腺。泪液在眼表面形成泪膜。泪膜由外向内依次分为脂质层、水质层和黏液层，脂质层由睑板腺、Zeiss腺、Moll腺所分泌。水质层由主、副泪腺所分泌。黏液层主要由结膜上皮杯状细胞分泌，部分由主泪腺分泌。泪液的总量、构成、分布和泪膜间隙改变都能导致干眼的发生。其中泪液渗透压的升高和泪膜不稳定是干眼症发生的两大核心机制，任何引起泪液渗透压升高或泪膜不稳定的因素都可导致干眼症的发生，且两者互为因果。大鼠的主泪腺分为眶内泪腺和眶外泪腺，眶内泪腺是哈德腺(Harderian gland)，眶外泪腺是浆液腺。
一、干眼症模型分类
按发病机制：按发病机制：可以分为泪液缺乏型和泪液蒸发过强型。
1、泪液缺乏型干眼症：先天性泪腺缺乏、老年性泪腺功能降低、自身免疫性疾病、泪腺外伤、感染和自律神经失调、长期使用某种眼药水、服用某些药物，或是长期戴隐形眼镜都会导致泪液不足型干眼症。
2、蒸发过强型干眼症：泪膜的脂质层能够防止水样泪液与空气接触而减少泪液蒸发，而脂质层主要来源于睑板腺。睑板腺功能障碍会导致泪膜结构改变，稳定性下降，引起蒸发过强型干眼症。
按照造模手段可以分为四大类：药物造模、手术造模、内源性物质缺乏和泪环境诱导。
二、药物诱导型
1、 胆碱能受体拮抗剂诱导
原理：副交感神经兴奋能增加泪液分泌，胆碱能受体阻断剂东莨菪碱是一种外周抗胆碱药物，能通过抑制副交感神经兴奋，竞争性抑制泪腺M受体，显著降低泪液分泌进而导致干眼症症状。
方法：在实验鼠皮下注射氢溴酸东莨菪碱注射液(3次/天)，后将动物安置在双面网格笼子里，复合风扇模拟干燥环境(湿度控制在35%-40%)，每个周期为5-10天。
特点：可建立泪液分泌不足合并蒸发过强型干眼模型。该造模方法可引起泪液分泌量显著减少、结膜杯状细胞数目减少、角膜荧光染色增加等干眼体征。东莨菪碱对眼表损伤程度较轻，对大鼠泪腺及眼表上皮细胞无明显影响，可用于制备早期轻、中度干眼症模型。
2、苯扎氯铵诱发干眼症模型
原理：苯扎氯铵是一种季铵阳离子，作为防腐剂广泛用于保存眼科制剂，其可破坏角膜上皮细胞层的浅表面细胞间的紧密连接，从而损伤角膜上皮细胞层的功能，使用含有苯扎氯铵的局部滴眼剂会使干眼症恶化。
方法：以0.2%的苯扎氯铵对实验鼠进行点眼(每眼5μL/次，3次/天)，连续7天。
特点：可建立严重型蒸发过强型干眼症。该造模方法可引起泪膜稳定性受损、眼表炎症、角膜上皮细胞凋亡与杯状细胞丢失、鳞状上皮化生等，其临床表现和相关组织病理改变均类似于人干眼症。
3、泪液高渗透压性干眼症模型
原理：泪液的高渗透压是干眼上皮损伤的关键因素之一，还可直接诱发眼表的炎症反应。正常人的泪液渗透压是(302. 0 ± 9. 7) mOsmol /L，干眼症患者泪液的渗透压是(326. 9 ±22. 1) mOsmol /L。用>316 mOsmol /L作为干眼诊断的诊断指标，其总体准确度优于其他任何一项干眼诊断指标。研究表明，小鼠眼表渗透压达到500 mOsmol /L可以导致眼表炎症反应。
方法：实验鼠以500 mOsm·L-1 氯化钠溶液点眼(5次/天)， 持续 42天。
特点：造模7天后，实验鼠角膜荧光素钠染色评分增加，角膜和结膜出现与干眼症患者类似的体征和组织病理学变化。
优点：简单可靠，重复性好。
三、手术造模型
1、暴露性干眼症模型
原理：通过手术减少动物瞬目频率，使泪液蒸发过多，泪液中黏蛋白缺乏，眼表组织继而干燥失活，角膜上皮细胞坏死缺损，从而引起角膜上皮屏障功能损害而出现干眼症状。
方法：将实验鼠麻醉后固定，消毒眼周皮肤，用手术线褥式缝合上下眼睑并分别固定于眶周相应皮肤上，造模环境应控制温度在(20-23)℃，相对湿度在(40±10)%。
特点：可建立蒸发过强型干眼模型，泪膜破裂时间缩短、角膜荧光染色增强、泪流量明显减少等，符合干眼症的临床症状。
2、泪液缺乏型干眼症模型
原理：摘除泪腺制成干眼模型。
方法：将实验鼠麻醉后固定，于耳下方约1 cm处沿皮纹做横行切口1 cm，暴露皮下微黄色圆形腺体(眶外泪腺)，分离周边包膜将其完整摘除，生理盐水冲洗，缝合切口；于眼外侧1 cm 处做纵行切口1 cm，暴露皮下白色质硬膜，切开见一三角形腺体(眶内泪腺)，将其完整摘除，生理盐水冲洗，缝合切口。
特点：术后2周后开始出现干眼症状，第4周症状显著。如果仅去除大鼠眶外泪腺可以导致泪液量减少 50% 和角膜荧光染色的逐渐增加。
四、内源物质缺乏型
维生素A缺乏干眼症模型
原理：维生素A中含有视黄酸、视黄醛、视黄醇等活性衍生物，可以维持正常视力和免疫系统。维生素A缺乏可导致上皮细胞过度角化、泪腺分泌减少、角膜上皮及结膜干燥而引起干眼症。
方法：以干酪素为主的维生素A完全缺乏饲料喂养。
特点：6个月后，可见泪腺萎缩、结膜杯状细胞减少、角膜上皮角化，致使泪液分泌的质与量改变，眼表上皮干燥失活，泪膜稳定性降低等干眼症症状 。
五、泪液动力学异常型干眼症
1、环境诱导型干眼模型
原理：干眼症的发病率和环境有着密切的关系。长期于空调房、密闭机舱、电脑房等环境的工作人群诱发干眼症的概率明显增加。为建立环境诱发干眼模型，可运用全智能化系统，对室内温度、气流量、湿度等进行严格的控制。
方法：将实验鼠放置在相对湿度低于 20%，温度为21-23℃的受控环境中，连续14 d可在实验鼠中诱导得到急性干眼症。在无抗胆碱能药物作用的情况下，将急性干眼症小鼠转移到温度为21-23℃、相对湿度为40%-60% 的标准环境中继续维持4个月，可诱导形成慢性干眼症。
特点：干燥环境刺激造模方法可与其他方法联用，得到更加稳定、严重的干眼症模型。
六、干眼症模型药效评价指标
1、一般情况：鼠是否好斗，及鼠掉毛、毛发断裂、揉眼的情况；
2、眼表检查：
动物干眼症症状可通过裂隙灯检查角膜、结膜等形态改变等进行评判。裂隙灯主要观察内容包括：①泪河宽度有无变窄；②角膜上皮的角化程度，是否出现水泡、溃疡、血管翳等异常；③角膜表层及下穹窿部有无碎屑；④结膜是否出现充血、乳头增生等；结膜囊结膜有无松弛形成皱褶：⑤睑缘是否充血；或出现不规整、增厚、外翻等；腺口是否有清亮或黄色浆液阻塞、腺管�：�。早期或轻度的干眼症动物模型裂隙灯检查大都无明显异常，须结合结膜荧光素染色试验进一步检查。
结膜荧光素染色检测方法：
滴2μL的1%荧光素钠于眼球结膜囊内，用0.25%氯霉素滴眼液进行冲洗，通过裂隙灯显微镜对染色情况进行等级评定。根据其着色程度和面积大小共分为四个等级：无染色为0分；散在稀疏的点状染色为1分；较为密集的点状染色为2分；染色呈片状为3分，若点数不均以比例较大者为准，评分越高角膜损伤越严重。
图注：A: 空白组角膜荧光素染色无异常; B: 模型组角膜荧光素染色示中央角膜点片状着色
3、泪液检查：包括泪液分泌试验和泪膜破裂时间。
3.1 泪液分泌试验(Schirmer test)：
是对结膜受刺激后的基础泪液和反射泪液总和的测量，可最直观估量水样液分泌。分别于干预第0天、7天、14 天时，腹腔麻醉或气麻后拉开实验鼠下睑。
A:试纸法。用眼科显微镊将1 mm × 15 mm的泪液试纸置于大鼠下睑外1 /3结膜囊内，2 min后取出，迅速测量试纸湿润长度(精确到0.5 mm) ，通常≥ 10 mm/5 min 为泪液分泌正常。每只大鼠重复检测3次，计算平均值。
图注：上：空白组；下：模型组
B:酚红棉线浸渍法。用眼科显微镊将酚红浸渍棉线置于大鼠下睑外1 /3结膜囊内，停留30s取出，棉线接触泪液润湿后颜色变红，测量红色棉线的长度(以mm为单位) 作为泪液分泌量的测量结果。
图注：上：空白组；下：模型组
3.2 泪膜破裂时间(tear break up time，BUT)
可分别于干预第0天、7天、14 天时检测各组泪膜破裂时间。用1滴生理盐水将荧光素钠试纸浸湿，用该试纸尖端轻触实验鼠下眼睑内侧并停留片刻，对实验鼠辅助眨眼3次使荧光素分布均匀，于裂隙灯钴蓝光下观察角膜出现第1个黑色干燥斑点的时间，每只实验鼠重复检测3次，计算平均值。通常BUT＞10 s为正常。
4、泪液蕨类试验
实验鼠眼部未使用表面麻醉药物，点样毛细玻璃管在下睑结膜囊泪阜处利用虹吸作用吸取泪液标本，尽量不接触眼表。将泪液标本涂至洁净载玻片上，25 ℃ (空调控制温度)下干燥10-20 min 后，置于光学显微镜下观察泪液蕨类物的形态并拍照。
图注：A: 空白组泪液蕨类结晶图像显示形态良好的蕨类物形成；B: 模型组泪液蕨类结晶图像分析显示蕨类物边界不清，中间连接的颜色逐渐变浅
5、角膜组织病理变化
采用HE染色法。实验结束后，用颈椎脱臼法处死鼠，取角膜组织于固定液中固定72 h，用梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋后制成厚度约为5 μm的组织切片，切片透明水化，HE染色、封片，于显微镜下拍照，观察组织病理变化。
图注：A: 空白组; B: 模型组
注：空白组和模型组的鼠角膜HE染色观察可见上皮分层良好，分4-5层，基底部细胞排列呈柱状，向角膜表面分化逐渐变成鳞状上皮细胞。空白组角膜组织细胞正常，上皮层宽厚，基质层细胞排列紧密，无明显病理特征; 模型组角膜组织上皮层显著变�。撞阆赴糠秩笔遗帕惺杷�，上皮细胞分层紊乱，细胞层数减少，出现空泡。
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