告别�：�&高背景！细胞免疫荧光从原理到成像（含共聚焦全流程）
细胞免疫荧光（Immunofluorescence, IF）是科研中最常用的可视化技术之一 —— 通过抗原抗体特异性结合，让目标蛋白带上 “荧光标签”，再借助激光共聚焦显微镜捕捉信号，就能清晰看到蛋白在细胞内的定位、分布甚至相互作用。而蔡司 LSM 980作为顶尖激光共聚焦系统，凭借超高分辨率和灵活的参数调节，能让实验结果更精准、图像更精美。本文就带大家从 “样本制备” 到 “图像采集” 全流程拆解，再用实战案例帮你快速上手！
细胞免疫荧光（IF）技术的核心的是抗原 - 抗体的特异性结合反应 —— 用荧光素标记的抗体作为 “探针”，精准识别细胞内目标抗原，再通过荧光信号可视化呈现抗原的定位、分布及表达水平。该技术兼具高特异性与空间分辨率，是蛋白定位研究、疾病标志物检测的核心手段，也是灵赋拓普细胞技术平台的核心支撑技术之一。
将荧光素直接标记在特异性一抗（即识别目标抗原的抗体）上。实验时，用这种标记好的一抗直接与样本中的目标抗原结合，洗涤后即可在显微镜下观察荧光信号。其优点是流程简单快捷、背景干扰低；而缺点则是灵敏度相对较低、灵活性差、抗体选择有限。
使用未标记的特异性一抗先与抗原结合，再用荧光素标记的二抗去识别并结合一抗，二抗是针对一抗物种来源（如兔、鼠）的抗体，最终通过二抗上的荧光素产生信号。其优点是灵敏度高、抗体选择范围广，缺点是流程较长、背景风险较高。
1、状态良好、无污染的细胞（实验结果可靠的前提）
2、4% 多聚甲醛（PFA）固定液（室温处理，避免冷处理细胞，导致细胞皱缩）
3、0.1%-0.5% Triton X-100（透化剂）
4、PBS（磷酸盐缓冲液）及PBST（磷酸盐缓冲液+ Tween-20）
5、封闭液（1%-5% BSA，阻断非特异性结合）
6、一抗（针对目标蛋白的特异性抗体，优先选择单克隆抗体，避免非特异性）
7、荧光标记的二抗（如 Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594等）
8、DAPI 或 Hoechst（细胞核染色剂）
9、抗荧光淬灭封片剂
1、细胞准备
◆ 将细胞接种在含爬片的培养板中，培养至 70% 融合度。（也可用玻璃培养皿进行样品制备；（尽量避免使用塑料培养器皿进行样品制备，而导致成像扭曲、像差和背景杂光，无法获得高分辨率、高清晰度的图像）。
2、清洗及固定（防止目标蛋白在后续步骤中扩散、流失或降解）
◆ 去除培养基，沿器皿侧壁加入PBS润洗细胞2-3次，请勿用PBS直冲细胞，以免造成细胞脱落；
◆ 加入 4% PFA 固定液，室温固定 10-20 分钟；
◆ 固定好的样片用PBS清洗3次，每次5分钟。
3、通透（抗体能够进入细胞内部）
◆ 用 0.1%-0.5% TritonX-100 溶液透化细胞，室温孵育 10 分钟。通透时间通常为5 ~ 20 min?。（该步骤可选；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）。
◆ 通透后的样本用PBS清洗3次，每次5分钟；
4、封闭（减少一抗/二抗与非特异性抗原位点的结合，减少背景染色）
◆ 加入1%-5% 的 BSA（牛血清白蛋白）溶液，室温孵育 60 分钟；
◆ 封闭结束可直接孵育一抗，无需再用PBS洗涤，目的是维持封闭环境，防止非特异性结合位点重新暴露。
5、一抗孵育（识别目的蛋白）
◆ 弃封闭液，加入含1% BSA的PBS配制的一抗，24孔板每孔可加入200-250ul，室温孵育2h，或4℃保湿过夜孵育；
◆ 孵育结束后，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
注：孵育的一抗可以重复利用，收集到干净的离心管，低温避光保存即可。
6、荧光二抗孵育（识别一抗，二抗上带有荧光团用于后续的荧光显微镜观察）
◆ 采用抗体工作液稀释荧光标记的二抗，细胞加入二抗溶液，室温避光孵育1小时；
◆ 孵育后，用PBST(0.1%Tween)清洗样片，清洗3次，每次5分钟；（PBST是使用可以更好的去除未结合的二抗，可以降低背景信号）。
7、细胞核染色（为目的蛋白做定位参照及反应细胞状态）
◆ 10ml PBS加入1ul DPAI原液，室温孵育 5-10 分钟，避光操作；
◆ 用 PBS 再次洗涤 2-3 次，每次 5 分钟。
8、封片（防止荧光淬灭）
◆ 在载玻片上滴加适量封片剂，采用弯头尖镊将细胞爬片倒扣在载玻片上，使细胞接触到封片剂；
◆ 小心覆盖盖玻片，避免形成气泡；
◆ 封片后，样本可以在避光低温条件下保存，建议尽快进行显微镜观察。
9、荧光显微镜观察（目的蛋白可视化）
◆根据不同的荧光染料，选择不同波段的激发光，DAPI为蓝色，488通道为绿色。
注意事项
◆ 信号弱或无：一抗失效/稀释过度；固定过度（PFA固定时间太长）；通透不足；二抗不匹配（一抗是鼠源，二抗则需要是抗鼠的）。
◆ 背景太高：封闭不充分；一抗浓度过高或非特异性结合；洗涤不彻底；二抗浓度过高；样本干燥等。
◆ 非特异性斑点：固定时产生沉淀；抗体聚集（使用前离心）；细胞状态差，有死细胞。
◆ 定位不对：固定不当导致抗原移位（膜蛋白不需要固定步骤）；错误使用甲醇固定膜蛋白。
◆ 荧光淬灭快：未使用防淬灭封片剂；曝光时间过长；封片时有气泡。
