开学第一课，学习小鼠脓毒症模型刚刚好
1模型简介
脓毒症（sepsis）是指由感染引起的机体器官功能障碍并且伴有多种细胞因子和炎性介质的诱导、合成和释放的综合症。
其发病机制异常复杂，可进一步转变为脓毒性休克 、严重脓毒症 ，也是导致多器官功能障碍综合征（ MODS ）的重要原因。
2造模方法
造模方式
目前的各类文献报道中的常见的脓毒症模型有：
（1）内毒素（LPS）模型
（2）盲肠结扎穿孔（CLP）模型
（3）结肠支架植入腹膜炎（CASP）
（4）大肠杆菌输注的脓毒症模型
（5）植入充满细菌的蛋白凝块
（6）肺炎诱导脓毒症模型
造模方法
模型 | 内毒素（LPS）模型 | 盲肠结扎穿孔（CLP）模型 | 肺炎诱导脓毒症模型 |
造模方式 | 通过腹腔注射细菌的致病成分内毒素 | 盲肠结扎穿孔，造成少量粪便持续流入腹腔导致腹腔感染 | 通过呼吸道给药、喷药等诱导肺炎，进一步诱发脓毒症 |
临床适应症 | 可以重现临床脓毒症模型中体温过低、呼吸急促、心动过速、 低血压的临床表现 | 准确地模仿临床肠道穿孔后造成的脓毒症及脓毒症相关休克 | 这是一个临床相关的模型，更加贴合临床的脓毒症 |
优势 | 具有稳定性、 重复性、可控性强 | 相对简单、 可重复使用 | |
劣势 | 短暂的内毒素输入会导致动物快速耐受或死亡，且成本较高 | 死亡率比较高、需要严格把控实验中导致死亡的因素或操作 | 气管内给药或支气管内给药需要麻醉，可能会影响免疫反应的发展 |
操作方法（盲肠结扎穿孔）
①动物分组：C57BL/6雄性小鼠（25-30g），动物适应性生长一周，随机分为2组，对照组和模型组，模型组采用盲肠结扎穿刺法，对照组做开腹、缝合处理。
②用异氟烷麻醉小鼠，用电动剃毛刀取出腹部毛发，并用碘伏对该区域进行消毒。
③用手术刀纵向切开皮肤中线，识别腹部肌肉组织的白线（中间的白色筋膜），并对其进行肌间切开和筋膜层和腹膜层的切开，使用钝解剖钳定位盲肠，分离盲肠并将其外部化，将小肠和大肠的其余部分留在腹膜腔内，在大多数情况下，盲肠位于腹部左侧。切口也可选在左侧髋关节处往上的位置。
④在指定位置对盲肠进行结扎，已获得所需的严重程度等级。
⑤盲肠穿刺前，将盲肠内容物轻轻推向盲肠远端，在盲肠穿刺时，轻轻吸出任何截留的空气或气体。在结扎和盲肠尖端之间的中间，在肠系膜到反肠方向上，通过单穿和全穿的方式对盲肠进行穿孔。
⑥拔出针头后，从肠系膜和抗肠系膜穿透孔中挤出少量（液滴）粪便，以确保通畅。
⑦将盲肠重新定位到腹腔中，而不会将盲肠中的粪便扩散到腹壁伤口边缘。
⑧通过简单的连续缝合闭合腹膜、筋膜和腹部肌肉组织。
3造模细节与差异
盲肠处理
用钝头弯镊轻轻带出盲肠，注意不要损坏肠系膜，确保不要结扎回盲瓣，穿孔的时候小心避免刺破血管，保持肠道的活性及连续性。
结扎比例
手术关键:
结扎的（ 盲肠远端到结扎之间的距离 ）：（ 结扎到回盲瓣的距离 ） 比例一致。
① 轻度败血症的比例 25% ：75%
② 中度败血症的比例 50% ：50%
③ 重度败血症的比例 75% ：25%
总结：越靠近远端结扎 症状越轻
在CLP模型中，盲肠结扎长度明显影响小鼠死亡率。但对于应按比例结扎或是按固定长度结扎无一致标准，其相应的死亡率也有较大差异 。
小鼠的盲肠长度变异较大，其范围约在2.8~4.3cm之间，四分位数间距（ 0.4cm ）个体间存在一定差异，若全部按固定长度结扎（ 较多文献选用1cm作为小鼠盲肠结扎的标准长度 ) ，可能会造成较大变异，影响实验结果。故结扎前使用软尺先测量整体盲肠长度（回盲部-盲肠末端） ，再按照比例结扎。
穿孔
穿孔数量：单孔、对穿孔（ 2孔 ）、多孔
针头规格：0.7#（22G）、21G、1.2#（18G）
挤出的肠内容物大小
粪便挤出后，将盲肠放回腹腔时注意不要将粪便蹭在外表皮肤上，若粪便没有进入腹腔可能会导致造模失败。
有研究表明，将造�：笕源婊�7d的小鼠解剖，解剖发现盲肠穿刺部位已经被腹膜、肠管完全包裹，限制了脓毒症反应的进一步加重。
术后护理
关键步骤：
术后，皮下注射预热生理盐水（ 37℃；5ml/100g ）促使动物复苏。
此外，预热生理盐水（ 37℃ ) 以避免体温过低，这很可能会影响造模的结果。
术后护理要求:
苏醒前，放置保温垫上保持体温
苏醒后，将动物放回温度控制（ 22℃ ）笼子里，自由进食、饮水，昼夜节律为12小时，饲养环境应保持干净，尽量无菌，防止造成二次感染。有条件可每6小时监测动物生命体征一次，统计死亡率。
4后续检测
评分观察
观察大鼠/小鼠的状态：外观，自主意识，自主活动，对刺激的反应，眼睛是否有分泌物，呼吸频率，呼吸质量。
成模标准
脓毒症成模标准:
动物出现发热，心率、呼吸频率明显加快，口鼻腔分泌物增多，脱水、皮毛竖立，体重下降，稀便，精神萎靡，嗜睡，蜷缩，少动，少食或拒食，眼角出现分泌物等，此外，至少一个器官功能障碍为严重脓毒症成模标准，常见能引起急性肾脏损伤。
动物于术后12h全身炎性反应达峰值，12 小时后观察小鼠活动次数明显减少，出现呼吸急促、精神萎靡、白细胞计数及血 IL-6 水平升高。其中出现3项也可判断为建模成功。
1.血清炎症因子检测：ELISA检测模型大鼠/小鼠血清TNF-α（肿瘤坏死因子-α）、（白细胞介素）IL-1、IL-4、IL-6等
2.肾脏检测（选用）：目前较为敏感的肾脏损伤标志物，如中性粒细胞酯酶、胱抑素C及最为常用的肌酐。该三项肾损伤指标均在 CLP 造�：�2h开始升高。
3.透射电镜：肾小管上皮细胞稍肿胀，细胞坏死、微血栓形成及炎症细胞浸润，有细胞空泡形成，空泡中含有被吞噬的线粒体结构。
