快来学！Top1区的高分文章，是如何把动物实验和生信完美结合的！
编者按
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今天跟大家分享一篇2018年12月发表在Diabetes上的动物模型构建+测序+实验验证的文章,题目为miRNA Regulation of the Hyperproliferative Phenotype of Vascular Smooth Muscle Cells in Diabetes。本文章通过构建1型糖尿�。═1DM）和2型糖尿�。═2DM）的大鼠动脉球囊损伤模型进行RNA 测序，生物信息学分析鉴定出6种可能引起糖尿病血管性疾病的miRNAs，分子实验和临床标本验证最终筛选出了低表达的miR-29c和高表达的miR-204参与了糖尿病血管性疾�。⑼ü徊降纳镄畔⒀Х治龊拖赴�、动物实验证明了在糖尿病疾病动物及细胞模型中，激活 miR-29c（靶向Emp2） 和抑制 miR-204（靶向Cav1)可防止动脉损伤后血管平滑肌细胞 (VSMC)过度增殖。
图注：文章流程图
文章结果展示：
1、作者构建了1型糖尿病和2型糖尿病的大鼠动脉球囊损伤模型，通过BrdU染色和H&E染色证明了两种糖尿病都可以加重中层 VSMC 的增殖反应，增加了血管损伤部位的动脉狭窄。
2、通过对上述模型的损伤血管组织进行RNA-seq及生物信息学分析，作者发现miR-195、miR-29c、miR-140和 miR-199a-5p 在 T1DM 和 T2DM动物模型中均下调，同时，miR-25 和 miR-204 在两种 DM 类型中均特异性上调。这六种 microRNA可能参与调节 DM 中 VSMC 的增殖反应。
3、在上述失调的6种miRNA 中，作者对它们在体外的功能进行了初步评估并利用临床上的人血管组织中绘制了表达谱，最终发现miR-29c 和 miR-204具有最高特异性调节糖尿病依赖性 VSMC 增殖表型的潜力。
4、接着作者利用高葡萄糖 (HG) 、胰岛素 (HI)以及血小板衍生因子(PDGF-BB)构建VSMC细胞模型，对miR-29c 和 miR-204进行敲低和过表达，通过EdU染色和细胞周期检测，进一步证明了miR-29c 和 miR-204在VSMC 增殖中的作用。
5、随后，作者对测序数据中的mRNA进行生物信息学分析，并对miR-29c 和 miR-204的靶标基因进行分析，结果表明与 VSMC 表型增殖相关的几种通路在两种 DM 模型中都被激活，两种 DM 模型中失调的 miRNA-mRNA 靶标富集细胞周期、细胞死亡、及迁移相关的分子通路。
6、为了进一步确定miR-29c 和 miR-204的靶标基因，作者进行了Ago 蛋白-RNA 免疫沉淀测定 (RIP)和荧光素酶报告基因实验，并利用上述构建的细胞模型进行功能验证，结果表明miR-29c 直接抑制 Emp2，这是调节 miR-29c 调节 VSMC 增殖的主要靶标，另一方面，miR-204 可以微调 CAV1 蛋白的表达，该调节将 miR-204 和 miR-29c 活性联系起来，都在激活 VSMC 增殖的分子网络中靶向 Cav1。
7、最后，作者利用腺病毒（Adeno-Combo-miR-29c-m/miR204-i）给药方式进行了体内实验，再通过FISH等实验验证，最终证明miR-29c 和 miR-204与它们的靶标 EMP2 和 CAV1 形成分子网络调控，在调节糖尿病中VSMC 增殖中起到关键作用。
总结
该文章通过高通量组学和适量的相关实验证明了通过过表达miR-29c和靶向抑制miR-204可显著减少糖尿病动脉狭窄，为临床糖尿病血管疾病的治疗提供了非�：玫陌斜旰椭瘟扑悸贰�
Diabetes是中科院医学1区Top期刊，在内分泌领域有着非常高的权威，该文虽发表于2018年，但其套路非常经典，一直沿用至今，如2021年9月发表于Molecular Medicine（中科院2区杂志）的一篇名为MicroRNA regulation of the proliferation and apoptosis of Leydig cells in diabetes的文章，基本是在该框架下设计的文章，值得大家学习品鉴。
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