造模难度系数高的脑胶质瘤模型，你不来学习吗？
脑胶质瘤呈浸润性生长，边界不清，恶性程度高，手术不能完全切除，且由于血脑屏障的存在导致化疗效果不佳，同时对放疗不敏感，故患者多数预后较差，5年生存率不超过5%，术后复发率较高，患者平均生存时间仅一年左右。为研究脑胶质瘤的发病机制，必须建立一种稳定、良好的脑胶质瘤动物模型。
目前建立脑胶质瘤动物模型的方法主要有诱发型、移植型和转基因型三类：(1)诱发型：包括化学物质诱发和病毒诱发，此类动物模型的生物学特征不稳定，且针对某些特殊病毒性肿瘤会表现出很强的免疫原性，故实际应用存在局限性；(2)转基因型：此类动物模型的生物学特征不稳定，来源有限，且实验成本高；(3) 移植型：移植瘤株存活性高且易于保存，动物模型易建立，生物学特性与人脑胶质瘤最为接近，实验成本低廉，是目前建立最多、研究最广泛的胶质瘤模型。
一、移植型脑胶质瘤模型
建立移植型的脑胶质瘤模型通常选用C6脑胶质瘤细胞，该细胞：(1)同时具备胶质瘤细胞和恶性细胞生物特性；(2)组织相容性强，与各种大鼠均能配适；(3)在大鼠脑内接种后肿瘤形成时间短，成活率较高，生存期较稳定; (4)生物学特性与人脑胶质瘤较为接近，有浸润性生长、新生血管形成的特性，建立模型的瘤体特征及生长方式更接近于人脑恶性胶质，呈现多形性、高有丝分裂指数、瘤内局灶坏死出血、脑实质浸润、肿瘤血管丰富且无包膜的特点，适合用来研究脑胶质瘤的发病机制和治疗方法。
细胞培养：
取C6脑胶质瘤细胞2×10?个，置于DMEM高糖培养基(含10% FBS、100 U /mL青霉素和100 μg /mL链霉素)进行传代连续培养。培养48 h，细胞融合80%-90%时，加入0.25%胰蛋白酶消化。倒置显微镜下观察到细胞回缩变圆，且有个别细胞脱落时加入完全培养基终止消化。台盼蓝排斥试验检测细胞活力，C6存活率应＞90%
注意：若细胞活性差，则需再次培养，直至检测活性符合造模需要为止。1000 r /min离心3-4 min，收集细胞，用无血清培养液吹打成单细胞悬液，采用血球计数板计数，将单细胞悬液密度调整为1 × 10?个/10 μL，置于37 ℃恒温振荡水浴中存放待用(目的：避免由于细胞死亡和沉底造成细胞密度不均匀)，尽量在短时间内(注意：不超过90 min) 接种。
二、脑胶质瘤模型造模方法
动物品系：SPF级SD大鼠，健康，6~8W，雄性，体重为180g-200g；
实验分组：正常对照组、模型组；
实验周期：4-6 weeks；
实验应用：用于研究脑胶质瘤引起的脑部损伤；
造模方法
(1)大鼠称重后以1.25％阿佛�。ㄈ逡掖迹┌�10ml/kg体重腹腔麻醉，麻醉成功后剃除颅顶部毛发，取俯卧位，将动物头部固定于脑立体定位仪上，保持颅顶水平位置；
图注：w88win优德脑立体定位仪
(2)手术区常规消毒，沿颅顶正中矢状线纵向切开长约2cm皮肤，分离暴露颅骨；
(3)钝性分离肌肉及骨膜，双氧水消毒及止血，在距前囱正中线前6mm、中线旁开2~3cm处，用5mL注射器针头钻孔,不可伤及硬脑膜；
(4-1)30 μL微量注射器抽吸25μL单细胞悬液，针尖调节至触及硬脑膜，沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下5.5 mm，退针1 mm后固定(目的：创建一个细胞悬液暂时存储空间，并防止其沿针道扩散)；
(4-2)缓慢将细胞悬液注入尾状核内(注意：如果太快会引起细胞悬浮液从脑内溢出，沿脑脊液播散，导致种植细胞数减少，肿瘤难以成长为实体瘤，或细胞在头皮下生长，造模失败)，注射时间为10 min(1 μL /min)，注射完毕后留针5 -10min(目的：留针可防止肿瘤细胞溢出，有利于瘤细胞沉积在穿刺道的底部，减少因虹吸效应导致细胞沿注射针回流出脑外，并延长肿瘤细胞与靶点脑组织的接触时间，从而提高成瘤率；同时有利于脑组织适应局部的压力增高，减少瘤细胞沿针道种植转移)，缓慢拔针(目的：防止接种细胞的反流)，骨孔用骨蜡密封�。�
(5)逐层缝合皮肤，生理盐水冲洗术野，喷洒适量抗生素，缝合皮肤，切口消毒，放入保暖箱内。大鼠麻醉苏醒后放回饲养箱饲养并观察。
三、术后检测
1、一般情况：
（1）正常组生长状况良好，活动、饮食均正常；
（2）模型组接种后随着时间延长，前期大鼠进食逐渐减少，体重逐渐下降，眼周有出血症状，中期甚或出现眼周瘀血，精神逐渐萎靡、反应迟钝、腹泻，后期上述症状明显加重，皮毛失去光泽，部分出现偏瘫、昏迷，甚至死亡。
2、全脑标本观察：
可在肿瘤细胞种植后至实验结束前分时间点获取全脑标本，以测量胶质瘤大体标本的体积，按脑表面的接种穿刺点作一冠状交叉切口，观察肿瘤生长情况并计算肿瘤体积= a×b×c(a为肿瘤的最大径，b为与最大径垂直的最宽径，c为肿瘤的高) ；
模型组大脑左侧肿瘤浸润性生长，较周围正常组织颜色深，脑中线向右偏，占位效应明显，切面可见肿瘤内出血和组织坏死。随着建模时间的延长，肿瘤的体积会不断增加。
图注：正常组脑中线居中（左）与模型组占位引起脑中线偏移（右）
3、HE染色(苏木精-伊红染色)：
模型组脑组织HE染色后可见肿瘤细胞呈椭圆形，核大深染，核分裂相多见，围绕血管生长活跃，排列紊乱，肿瘤组织内有出血和坏死区域，伴有丰富的膨胀的微血管，微血管内充斥着大量的红细胞，并被坏死区域包围。
图注：C6脑胶质瘤倾向围绕血管生长
图注：C6脑胶质瘤接种后7天、14天、21天
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